打开功能基因组学与未来治疗学的大门

           　　当前，医药、生物学界的科学家有一种较为普遍的看法：小片段干
扰核糖核酸（siRNA）是一片钥匙，用它可以——
　　美国纽约洛克菲勒大学RNA分子生物学实验室Yair Dorsett博士与Thomas
Tuschl博士在《自然杂志药物发现综述》网络版四月号上共同撰文介绍了siRNA
的最新研究动态。
　　该文指出，在基因功能研究方面，可以特定休眠基因表达的分子是研究用的
强有力工具。siRNA就是最新发现的一种顺序特异性基因休眠制剂。其应用前景
已经激发众多的生物技术组织与研究机构开发siRNA库以用于在哺乳动物细胞基
因组范围内的高通量筛选。
　　文章指出，我们正处于用RNA干扰（RNAi）方法推动的功能基因组学新时代
的黎明。虽然存在着与siRNA治疗性应用有关的技术挑战，例如合成、释放与特
异性，但目前却具有胜过其他基因休眠途径的许多优势。基因休眠的siRNA途径
蕴藏着巨大的治疗希望，因为siRNA与miRNAs一样，由细胞自然应用于调节基因
表达、没有毒性而且高度有效。应用siRNA作为治疗的一个可能缺点是，如果长
期应用siRNA，在某些细胞类型理论上可能形成外部对内生miRNA基因功能的干扰。
　　siRNA是最新用于休眠基因表达的核酸分子之一。它是1998年被发现的RNA干
扰途径的受动器分子。当时AndrewFire博士和CraigMello博士将双股RNA(dsRNA)
注射到线虫体内，引起了含有与dsRNA触发相同顺序的细胞质mRNAs的强力顺序特
异性降解。在线虫体内发现RNA干扰，表明动物中存在转录后基因休眠（PTGS）。
RNA干扰被迅速开发作为研究基因功能的工具，人们发现这一途径在原生动物和
几乎所有的真核细胞中发生。
　　早期使用的是长dsRNA，但是长dsRNA在大多数哺乳动物细胞中不起作用，因
为它引起有抗病毒效应的干扰素（IFN）反应，往往导致细胞死亡。对siRNA结构
进行研究后，研究人员发现它可有效地减少许多哺乳动物细胞类型的基因表达，
而不会引起干扰素反应。
　　RNA干扰是目前在功能基因组学中应用最广泛的基因休眠技术。有关专家表
示，先前对治疗性反义核酸的广泛研究将能促进治疗性siRNA的开发。
　　■基因休眠“三剑客”
　　科研人员已经开发出一些通过具有顺序特异性的信使核糖核酸（mRNAs）抑
制基因表达的不同类型分子，希望研发出有治疗作用的制剂。其中三种主要的基
于核酸的基因休眠分子是经化学修饰的反义寡核苷酸（ODNs）、核酶（核酶s）
和siRNA。它们通过不同的机制休眠基因表达。
　　ODNs：通常有20个核苷的长度，通过与前mRNA和mRNA杂交产生一种核糖核酸
酶H（RNaseH），该酶能特异降解形成RNA-DNA双螺旋的RNA链。如果修改一种方
法能阻止RNaseH的作用，那么ODNs就可抑制mRNA经空间位阻途径的转录，或抑制
前mRNAs的接合。
　　核酶：通过“沃森－克拉克”碱基对与RNA结合，催化磷酸二酯主链的水解
来靶向降解RNA。在不同类型的核酶中被研究最广泛的是“锤头状的”核酶。在
核酶内具有催化作用的重要残基是由靶向补充顺序结构侧接的，这些顺序结构侧
接靶向RNA的分裂位点。由核酶进行的分裂需要二价离子（如镁离子）参与，并
且还依赖于靶向RNA结构与利用度。核酶与靶向RNA在细胞内利用定位信号进行共
同定位，大大增加了它们的休眠效率。这种锤头状的核酶很简短，可化学合成或
从遗传媒介中转录，从而可在细胞内连续不断地产生。
　　siRNA：在自然界发现的siRNA是由被称为Dicer的III型Rnase酶对长dsRNA的
细胞质处理后产生的。Dicer将长dsRNA分裂成双份的21~28核苷的siRNA。RNA干
扰机制的构成能特异性地识别双股siRNA，并且将单股siRNA链结合成蛋白质复合
物，称为RNA诱导的休眠复合物（RISC）。RISC能分裂mRNAs。与核酶一样，siRNA
可以通过化学合成产生或从转录短的双股发夹样RNAs的遗传媒介表达产生，这些
RNAs在细胞内被处理成为siR鄄NA；与ODNs和核酶不同，siRNA不能有效地靶向前
mRNAs而用于哺乳动物细胞的降解。
　　siRNA与称为“miRNAs”的非编码RNA分子相似，这些分子是细胞用于调节基
因表达的。成熟的miRNA是单链的21~22核苷分子，它们组合成蛋白质复合物(miRNP)。
这种复合物与核糖体联合，可抑制mRNAs的转录。如果呈现具有补充作用的底物，
那么一个miRNA分子可以发挥与一个siRNA分子同样的作用，指导多次的mRNA降解
过程。
　　■基因休眠的不同途径
　　基因休眠的效率取决于休眠反应物的浓度、转染技术、细胞类型、靶向位点
的选择、化学修饰以及数据分析的时间点。到目前为止，还没有一项研究分析将
这些参数全部考虑进去。新研究显示，不管靶向位点利用度如何，单个siRNA分
子就能影响休眠的效率。这一发现进一步使ODNs和siRNA的比较研究变得复杂起
来。
　　靶向利用度在各种基因休眠技术中的地位仍然是一个争论不休的问题。大多
数的研究已经发现，siRNA要比所有类型的ODN有效，而且持续时间更长。另外一
些实验也表明，siRNA也比核酶和DNA酶更有效。由此看来，通过RNA干扰休眠基
因表达的长发夹环比锤头状核酶的更有效。
　　三种用于靶向mRNA降解的途径都具有对基因表达非特异性作用的潜力。经硫
逐磷酸酯修饰的ODNs，可能具有毒性，因为它们是通过结合内源性蛋白起非特异
性作用的。当应用高浓度ODNs产生基因休眠活性时则进一步使这一毒性问题复杂
化。分析发现，具有CpG主要结构的ODNs通过结合钟样受体（TLRs）能诱导INFs
的先天免疫反应。这种非特异性质可能是用ODNs取得成功治疗的原因所在。
　　核酶像ODNs一样，能不经辅助而与它们的靶标杂交，休眠基因也需要较高的
浓度。核酶经化学修饰时可以发生非特异性的作用。应用RNA定位信号可以使较
低浓度的核酶达到强力的休眠作用。最近的数据已经证明，人类和小白鼠表达的
TLRs是分别通过尿苷/鸟苷和富含单链RNA寡核苷酸激活的。这些通过单链RNA激
活的TLRs看来是在浆树突状细胞的内涵体组份中发生的，并且导致干扰素和其它
细胞激动素的表达。如果在机体内释放的经化学修饰的siRNA和核酶被内吞和变
性，那么它们可能激活这些特殊的TLRs，这取决于siRNA顺序。这种潜在的副作
用像反义ODNs中的CpG主结构一样，对于病毒感染或者癌症的治疗可能是有益的。
　　一些报告已经证明，siRNA在中等浓度的转染不能对基因表达产生完全的非
特异性作用。然而三项最近的报告确定，RNA干扰在哺乳动物细胞中的应用可以
非特异性地影响基因表达，这与siRNA浓度、细胞类型、释放的反应物以及siRNA
表达的模式等有关。这些非特异性作用包括涉及干扰素反应的基因子集的刺激。
令人感兴趣的是，观察采用产生短发夹RNA的遗传介质或siRNA治疗小白鼠，显示
出干扰素反应基因的诱导。
　　除了非特异性的作用外，基于核酸的基因休眠分子也产生脱靶作用。脱靶作
用的水平依赖于休眠模式和核酸混合物的稳定性。如果不仔细选择siRNA的话，
具有对一个mRNA靶标有部分补充的siRNA作用就像内生的miRNAs一样，抑制转录
或使mRNAs易于降解。随后的研究比较了由不同的siRNA靶向相同的转录产物所产
生的基因表达谱，显示在任一siRNA链的5''端到mRNA之间的11~14个核苷补充的极
少情况下，可以引起转录水平的重复减少。
　　■产生siRNA的遗传媒介
　　在发现锤头状核酶之后，对合成核酶用于治疗的探索十分热门。人们还研究
将小的RNA分子作为基因治疗中的靶向反应物。开发能从一个RNA聚合酶III启动
子（polIII）产生锤头状核酶的遗传媒介，推动了用于产生siRNA的相似遗传媒
介。从遗传媒介产生siRNA主要是通过模拟一个miRNA前体的发夹RNA的转录完成
的，这样可在细胞内加工成siRNA。
　　一些研究小组已经开发出腺病毒、腺相关病毒（AAV）、逆转录病毒和静水
病毒遗传媒介，在转导的组织培养细胞和机体中通过发夹RNA从polII或pol
　　III启动子的转录开始RNA干扰。这些病毒遗传媒介将可作为基因疗法的一种
模式。为了增加其供细胞培养研究的效用，已开发出介导可诱导的siRNApolIII
表达的遗传媒介。
　　基于polII的可以在机体中产生几百个碱基对而不会诱导干扰素反应的发夹
RNA遗传媒介的开发，已经为哺乳动物中的RNA干扰提供了可供选择的方法，同时
也允许培育出组织特异的“基因敲除”小白鼠。为了克服因细胞质中存在长dsRNA
而诱导的干扰素反应，要防止RNA被输入到细胞质中。
　　■机体中siRNA的释放
　　研究人员应用各种方法已经成功地在机体中释放ODNs和核酶。静脉内注射是
目前临床试验上最普遍的释放ODNs的方式。将siRNA、产生siRNA的质粒或产生siRNA
的病毒释放到哺乳动物模型生物体中的方法包括电穿孔，局部与系统注射。因为
不同大小的动物以及不同组织对有效释放有不同的需求，目前还难以明确哪些释
放方法导致最有效的基因休眠。
　　在生理溶液中进行siRNA的高压尾静脉注射，是成功地将siRNA释放到血管丰
富的小白鼠组织中的第一种方法，可使肝脏的靶向基因表达降低90％，在肺、肾
脏、脾脏和胰腺的降低范围相对要小一些。这种基因休眠是暂时的，在某些情况
可持续一周以上；基因休眠的水平也不是绝对的，动物之间存在明显差异。
　　开发产生siRNA的病毒作为基因疗法模式之一可用于治疗显性人体疾病以及
用于研究哺乳动物模型系统的基因功能。一些不同类型的病毒经过基因工程处理
可产生siR鄄NA。重组的AA病毒（AAV）可以介导分化与非分化哺乳动物细胞中转
基因的释放与长期表达。将产生siRNA的AAV注射到小白鼠的大脑中能在注射部位
附近产生有效的基因休眠，长达7周。通过注射到尾静脉，或直接注射到大脑的
方式，可将产生siRNA的腺病毒释放到小白鼠的肝脏，这样也可引起基因休眠。
能够转导非分化细胞并且逃避发育期间转录休眠的产生iRNA的静水病毒已用于将
siRNA释放到胚胎干细胞中，以产生基因敲除小白鼠。在目前，还没有显而易见
的理由来解释，为什么不能通过采用与在目前的I期和II期临床试验中释放核酶
用于治疗HIV相似的方法，将产生siRNA的病毒遗传媒介应用到基因疗法中。但在
组织培养模型中，siRNA已表明能成功地靶向HIV。
　　要将siRNA用于治疗目的，就必需开发一些方法来温和地在机体释放siRNA。
目前已经开发出用于释放ODNs和摄取经化学修饰的ODNs的一些方法还不完善。最
近发现能提高一些高分子(包括ODNs)透过皮肤能力的小分子，具有用于通过皮肤
贴剂系统释放siRNA的潜力。类似于肺部基因释放的气雾剂方法不久也可用于温
和释放siRNA。化学修饰是否能以及哪些化学修饰能提高siRNA在机体的释放，仍
待观察。为了不限于目前的ODN和核酶化学修饰的范围，目前正在开发用于siRNA
的新型化学修饰。
　　■用siRNA筛选功能基因组
　　RNA干扰是用于鼠基因功能分析的工具，并可创造出“基因敲除”小白鼠，
在某些方面优于同源重组的经典方法。在小白鼠中由RNA干扰结构介导的休眠在
微生物管道评价上已经稳定地过关。采用RNA干扰，可以不费力地靶向特异的不
同基因接合点产生破坏作用。在理论上可以采用一种转基因结构全部敲掉功能上
多余的多种拷贝基因。通过靶向一保留的区域，可以敲掉整个基因簇。RNA干扰
也可以克服目前在创造两种基因双敲除小白鼠中的难点。
　　▲在哺乳动物模型中的应用
　　siRNA还扩大了可以在哺乳动物模型系统中完成的实验范围。例如，为了确
定在特殊发育阶段某些过程所需要基因的相对数量，现在可通过简单改变细胞中
表达的siRNA数量，按空间和时间方式来调整基因剂量。目前在时间和空间上创
造有限敲除小白鼠的困难包括鉴定可以按所需模式表达重组酶蛋白的调节区域。
一些研究小组已经应用RNA干扰通过产生siRNA的质粒或病毒的局部注射或电穿孔
（Electroporation）来迅速避开这一问题。
　　但是，目前还不能确定小白鼠中siRNA的长期表达是否可引起副作用。从理
论上说，发夹RNAs的高水平长期表达可与内生表达的miRNAs竞争结合到miRNPs上。
　　目前，一些接近基因组范围的RNA干扰筛选已经在C.elegans线虫和果蝇中应
用长dsRNA进行。这些筛选已经鉴定了涉及细胞分裂、凋亡以及细胞形态学等基
本过程和脂肪新陈代谢等生理学过程的部分基因。
　　应用ODNs或核酶降低特异基因表达的反义遗传途径，在用于药物靶标确诊方
面已经取得成功，但是还未跨越基因组范围靶标鉴定的障碍。因具有低浓度的高
效基因休眠、易于发现可接近的靶向位点、高度特异性、良好的稳定性和适度低
成本的自定义siRNA合成特性，RNA干扰已经成为哺乳动物组织培养的功能基因组
研究的首选途径。采用合成siRNA或发夹表达的一些大范围RNA干扰筛选已经在哺
乳动物组织培养细胞中进行；这些筛选已经鉴定的基因涉及细胞凋亡、信号传导、
蛋白质稳定性调节以及紫外线辐射损伤反应。
　　哺乳动物的RNA干扰筛选可以在现有组织培养模型的任何过程中进行。迄今
为止进行的哺乳动物siRNA筛选也适合使用细胞外制剂来诱导特殊过程。大体上
来说，哺乳动物细胞中的RNA干扰筛选在易转染的、迅速分化的粘附细胞类型中
受限。目前用于释放siRNA到非粘附细胞的电穿孔技术可能具有用于高通量筛选
（HTS）的潜力。未来的小分子药物筛选可鉴定刺激siRNA在特殊细胞类型中吸收
的分子。能够转导到原始细胞的病毒遗传媒介最近已经应用为释放RNA干扰筛选
的模式。随着同类技术的开发，用于RNA干扰筛选比率限制的步骤不久将用于筛
选设计和数据分析。
　　▲微阵列技术的影响
　　RNA干扰通过cDNA微阵列的应用在潜在的药物靶标鉴定的确认中有帮助。在
鉴定偏离正常组织基因表达而在病变组织表达的基因研究中已经产生大量的微阵
列数据。这些微阵列研究通常鉴定成千上百的已改变的基因表达，它还难以鉴定
相关的药物靶标；设计靶向在病变组织过度表达基因的siRNA现在可迅速鉴定治
疗特殊疾病的药物靶标。
　　目前用于哺乳动物细胞基因组范围筛选的比率限制步骤反映出资源的可用性。
结合96孔或384孔平板格式，阳离子转染机器人技术与图像识别软件的技术已经
设计用于在哺乳动物组织培养细胞中进行接近基因组范围的筛选。用于HTS处理
的新型硬件平台也正在开发。最近，已经开发出微阵列芯片用于玻片上的质粒或
siRNA打点标记，并且进行反向转染，以进行哺乳动物细胞的快速筛选。RNA干扰
微阵列的缺点是只有粘附细胞可以分析，应用的阳离子转染反应物受限于特殊的
细胞类型，因此必须开发出能够长期保存RNA干扰微阵列的技术。
　　▲设计的重要性
　　因为具有脱靶作用的可能性随着基因组容量而增加，siRNA设计的重要性也
随之增加。最近的实验研究通过细化选择siRNA的标准参数已经帮助开发siRNA库，
而在siRNA双链的两端头几对碱基的热力学稳定性对于确定哪根siRNA链将组合成
RISC是至关重要的。一些研究小组正在设计用于高通量开发产生发夹质粒库的方
法。虽然用于选择有效siRNA的参数也应用于发夹遗传媒介的建构，但是它们可
能不太可靠，因为DicerRNaseIII分裂发夹的位置并不能很好地确定。除了良好
的siRNA设计之外，针对同一靶标的有效siRNA的收集也能减少脱靶作用。这种收
集策略能减轻任何具有脱靶作用siRNA的影响。这样产生的siRNA可被进一步提纯，
以除去少量的可诱导干扰素反应的dsRNA。
　　尽管RNA干扰筛选相对简便易行，但是与经典的遗传筛选相比也有一些缺点。
最明显的是，经典的遗传筛选可以鉴定不能编码区域的突变，也可以产生显性阴
性或功能获得的突变，而这些往往是有用的，有时对于了解基因功能是必不可少
的。为了克服这些缺陷，有些研究人员开始应用阵列的腺病毒cDNA表达库（敲入
）与表达短发夹RNAs的阵列腺病毒库相结合方法进行研究。另一种缺陷是siRNA
几乎从不完全耗尽靶标mRNA，通常在鉴定一个有效的siRNA之前必须筛选一些
不同的siRNA。在用siRNA筛选时要考虑的另一层复杂性是细胞类型。可利用的RISC
数量在细胞类型之间是各不相同的，这种不同数量可反映内生的miRNAs与RNA干
扰机制竞争的相对水平，且是RNA干扰效率的一个限制因素。从长远来看，用于
每一个基因的siRNA鉴定的特异性和有效性将有助于克服其中一些问题。
　　有关专家认为，正在开发用于哺乳动物细胞高通量基因组范围的RNA干扰筛
选的研究机构在生物医学研究中将具有竞争优势。采用蛋白质组方法来补充这些
siRNA筛选将可产生相对明晰的研究前景。
　　■基于siRNA的治疗
　　目前，一些ODN和核酶分子已处于临床试验阶段，一种ODN制剂——福米韦
生（Fomivirsen，Vitravene）——已经由美国FDA批准用于治疗眼睛的巨细胞
病毒感染。到目前为止，在临床试验中的大多数ODN制剂是经硫逐磷酸酯修饰的ODNs
或经硫逐磷酸酯修饰的ODNgapmers，它们存在诸如高浓度毒性和其靶向RNAs的低
亲和力。一些含有其他类型化学修饰物的第二代ODN目前也在进行临床试验，预
期比硫逐磷酸酯ODN这一代产品的疗效更好。
　　siRNA及其在哺乳动物细胞中的功能是3年前发现的，还没有时间来进入临床
试验。预计在基于siRNA的生物技术公司建立之后，siRNA的治疗研发速度能迅速
赶上ODNs和核酶的。目前一些原理性验证实验已经证实siRNA的治疗潜力：siRNA
能防止小白鼠得暴发性肝炎、病毒感染、脓血症、阻止肿瘤生长以及引起眼黄斑
变性的新血管形成。
　　已知通过高压静脉注射释放siRNA在小白鼠肝脏中最有效，一些研究小组已
经开始试验siR鄄NA作为各种肝脏疾病治疗制剂的潜力。通过靶向肝脏内生的介
导凋亡的基因表达，采用siRNA靶向Caspase8或FAS细胞死亡受体预处理的小白鼠，
能防止其患各种反应物引起的急性肝功能衰竭。在肝脏被诱导凋亡的反应物用损
伤之后，采用相同的siRNA治疗小白鼠，也能防止小白鼠肝功能衰竭。其他的研
究小组已经成功地证明siR鄄NA通过直接靶向病毒，用于乙肝病毒（HBV）感染治
疗的潜力。理论上说，一个有复制能力的HBV基因组及其siRNA靶向部分的共同释
放能有效减少病毒复制和蛋白质的产生。但应用到实际的感染时，siRNA是否能
有效地降低病毒水平还有待证实。
　　基于核酸的基因休眠最优化分子在机体中的效力需要考虑许多因素。这种休
眠分子在循环系统以及组织中必须是稳定的，在一定程度上应能与血液蛋白结合，
它不仅是无毒的，而且能防止休眠分子通过排泄过快丢失。现在，许多研究已在
鉴定能降低核酸对核酸酶攻击的易感性，同时保留足够基因休眠活性的化学修饰
物。对于满足系统释放需要的折衷方法的最好说明是目前在临床试验中的硫逐磷
酸酯修饰ODNs。这种修饰物能降低ODN对其靶标RNA的亲和力，它能通过增加其稳
定性、保持力、细胞摄取以及体内分解而增强分子在机体中的效力。这是因为硫
逐磷酸酯修饰物能增加ODNs对血液蛋白的亲和力，并且也防止核酸酶的直接作用。
　　一些研究小组正试图鉴定能增加siRNA稳定性同时保持良好的休眠效力的化
学修饰物。研究显示，硫逐磷酸酯修饰物在siRNA双链中耐受性很好，这提示与
其ODN和核酶配对物相似，细胞会摄取这些类型的siRNA。不过，目前对化学修饰
的siRNA在机体中的效力报告还没有。
　　siRNA作为治疗制剂的高度潜力已经促使人们努力开发新型的核酸化学修饰
物，其中一些是对siRNA结构特异的。可以预见在不久的将来将开始许多涉及治
疗性siRNA的临床试验。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 余志平 编译